干细胞产品因其独特的活细胞属性和复杂的作用机制，在毒理学评价策略中与传统化学药物或生物制品有很大差异。关节腔给药的干细胞产品在非临床研究中面临多维度技术挑战，需结合关节腔解剖特性、细胞生物学特点综合考量，其中主要考量点包括：动物的种属选择、剂量设计、特殊的检测指标、成瘤性和致瘤性等。

本文基于有济医药既往研究经验和对相关指导原则的解读分析，系统梳理了关节腔给药的干细胞产品的非临床安全性评估思路和策略，以期为相关领域的研究者提供参考。

在国外，已有多款上市的关节腔给药干细胞产品，例如：2009年Chondrocelect在欧洲获批上市，是欧洲首个获批的软骨修复细胞治疗药物； 2012年Cartistem在韩国获批，是全球首创的异基因干细胞药物，用于植入治疗关节软骨缺损；StemOne是由印度药物管制总局批准的?膝关节骨关节炎（OA）?同种异体细胞疗法。

在国内，虽然还没有关节腔给药的干细胞产品正式上市，但已有一些产品处于临床试验阶段，有望填补该领域的空白。例如，西比曼生物科技的异体人源脂肪间充质干细胞注射液（AlloJoin?），是中国第一个获批进入III期临床试验的治疗膝骨关节炎的干细胞药物；上海爱萨尔生物科技有限公司治疗膝骨关节炎的间充质干细胞药品也已进入临床III期，有望成为国内首批商品化的关节给药的间充质干细胞药物。

干细胞及其分化的功能细胞和/或其分泌的活性物质、处方中非细胞成分等可能会对中枢神经系统、心血管系统、呼吸系统等产生影响。根据相关指导原则的要求，在首次临床试验前（IND阶段），应结合细胞产品的特性、细胞在体内的分布特征评估是否存在安全性担忧，决定是否进行安全药理学试验。

对于膝关节给药，通常为充分考察干细胞药物对中枢神经系统、心血管系统、呼吸系统等产生的影响，会考虑采用替代的给药方式，如静脉单次注射开展安全药理试验。这种给药方式不但可以考察干细胞在全身暴露情况下的药理作用，还可以排除由关节腔给药所引起的相关症状（如跛行等）对中枢神经系统评估的干扰。应注意的是，需要结合供试品特性充分评估目标产品是否适合静脉注射，否则需要采用临床拟用途径。

2.一般毒理学试验

一般毒理学试验主要用于评价干细胞产品的系统毒性和局部毒性等。应基于干细胞产品的生物学特性、可能的风险因素和安全性担忧，采用基于风险、科学导向的思路设计方案。

对于膝关节给药，为充分考察干细胞产品的毒性风险，在试验中的给药方式，应最大程度地模拟临床拟用给药方式，给药频率和试验期限应能反映临床使用情况。结合产品的预期存续特点和在动物中的药代动力学特征设置合适的给药次数、给药频率和试验期限，并确保试验中动物暴露于受试物。

膝关节腔给药的干细胞临床通常单次用药，或间隔1个月重复用药1~2次，因此IND阶段通常开展至少2周的重复给药毒性试验，以满足支持给药期限不超过2周的临床试验。通常情况下，即使拟定的临床给药期限不超过2周，委托方也会考虑直接开展4周或更长周期的重复给药毒性试验，尽可能满足后续开展更长的临床试验或NDA的要求。

3.成瘤性和致瘤性试验

成瘤性试验主要用于评价动物接种干细胞产品后，由接种的细胞自身形成肿瘤的可能性。致瘤性试验主要用于评价干细胞产品通过临床拟用途径给予动物后，促使动物的正常细胞转变为肿瘤细胞的可能性。在开展首次临床试验前，应基于干细胞产品的生物学特性、体外处理方式/程度、细胞存续特点、临床拟用给药途径等因素，先初步评估干细胞产品的成瘤性和/或致瘤性风险，再确定评价策略。

对于成瘤性和致瘤性风险较低的成体干细胞产品（如未经基因修饰的MSC），通常应在IND阶段至少完成体外成瘤性评价，如体外软琼脂克隆形成试验、核型分析、端粒酶活性检测等。

对于成瘤性和/或致瘤性风险较高的干细胞产品（例如多能干细胞产品、其他分化程度较低的干细胞产品、药学和/或已有非临床研究提示风险较高的产品等），应完成体外和体内成瘤性试验。若成瘤性试验出现阳性结果，或在一般毒理学试验中发现动物来源的癌前病变、可疑癌变时，还应完成致瘤性试验。

对于拟用于非晚期肿瘤适应症且风险较低的干细胞产品，通常在NDA前完成体内成瘤性和/或致瘤性试验。

对于膝关节给药的干细胞产品，通常会参考《中国药典》（第三部）的要求，成瘤性试验多采用皮下给药的方式。根据最新发布的《人源性干细胞产品非临床研究技术指导原则》的要求，致瘤性试验通常采用与临床拟给药途径一致的给药方式，即膝关节腔注射。

当在动物成瘤性和/或致瘤性试验中观察到肿瘤发生时，需进一步确认肿瘤细胞的种属来源，以明确其是来自于接种的干细胞产品还是来自于受者。目前非临床评价中通常采用免疫组化的方法进行肿瘤来源确认。

4.遗传毒性

常规非修饰的干细胞产品通常不需要进行标准组合的遗传毒性试验。

5.生殖毒性

对于关节腔给药的干细胞产品，通常IND阶段无需考虑进行生殖毒性评估。因为膝关节腔内注射属于局部给药，干细胞主要滞留于关节腔，进入全身循环的比例极低。若无证据表明干细胞或分泌因子进入血液循环，生殖毒性风险可忽略。如果担忧多次关节腔注射可能提升系统暴露概率，也可在重复给药毒性试验中关注生殖器官的病理学检查结果（如睾丸/卵巢组织切片）。

6.制剂安全性

应根据干细胞产品的特点与临床应用情况，开展终产品制剂的刺激性和溶血性试验。

关于毒理学试验动物种属的选择，应基于干细胞产品的风险大小、相关动物种属/模型的可获得性等因素综合分析，总体目标是尽可能最大程度地阐明干细胞产品的安全性特征，为人体安全性提供有价值的预测信息。在可行的情况下，尽量考虑获得两种相关动物种属的非临床安全性信息。

选择相关动物时主要但不限于以下因素：

（1）动物对人源干细胞及其分化后细胞的生物学反应与预期的人体反应的相似性；

（2）动物对人源干细胞的免疫耐受性；

（3）动物的解剖学和病理生理学特征与拟定适应症人群的相似性；

（4）临床拟用给药途径/给药方式的可行性；

（5）涉及基因修饰的干细胞产品，还应考虑动物对目的基因或基因表达产物的敏感性、表达产物在动物体内的生物学效应。

在毒理试验之前，通常会开展关节内给药的药效学研究，药效学动物模型可以为毒理试验的种属选择提供参考信息。根据文献资料，目前关节腔给药的干细胞产品在非临床安全性评价研究中，常见的动物种属包括小鼠、大鼠、兔、猴和犬。

除以上五种常见的动物种属外，免疫缺陷动物和疾病模型动物也可以在一定条件下选择使用。

免疫缺陷动物：对于干细胞产品（尤其是异种来源），在免疫正常动物中可能因宿主免疫排斥被快速清除，导致无法观察其长期存活、迁移、分化及潜在的异常增殖，如致瘤性。所以应用免疫缺陷动物可延长干细胞在体内的存活时间，能够更精准地评估其在体内的长期生物学行为，这是致瘤性评价的关键。但免疫缺陷动物无法替代免疫正常动物评估免疫相关毒性。部分干细胞（如间充质干细胞）具有免疫调节功能，如抑制 T 细胞活性，免疫缺陷动物无法反映其对正常免疫系统的干扰。但是，免疫缺陷动物尤其是重度缺陷模型，如 NOG 小鼠，对饲养环境要求严苛，需无菌隔离且价格昂贵，大规模试验的成本和操作难度明显高于免疫正常动物。

疾病模型动物：对于膝关节给药的干细胞产品，需结合产品的作用机制分析是否需要使用疾病模型动物。例如，对于部分在体内容易异常分化的干细胞，或有炎症因子干扰，可以考虑使用疾病模型动物。首先，疾病模型动物可以模拟膝关节病理微环境，评估特异性风险；其次，可以揭示干细胞与病变组织的相互作用毒性，例如，滑膜炎症分泌的 IL-6 可能会抑制干细胞的免疫调节功能，甚至诱导其分泌促炎因子，加重局部炎症。然而，目前动物模型与人类疾病的病理情况还存在一定差异，例如种属差异，动物模型的软骨退变速度远快于人类，需通过延长试验周期来弥补；炎症反应差异，如啮齿类动物的滑膜炎症以中性粒细胞浸润为主，而人类骨关节炎以巨噬细胞和T 细胞为主，需通过基因编辑模型动物（如 IL-1β 转基因小鼠）优化炎症表型。

综上所述，每种动物种属/模型均有其优点和不足，没有一种动物种属/模型可全面预测干细胞产品在患者人群中的有效性和安全性。因此，在选择动物种属/模型时，应评估所采用的动物种属/模型与人体的相关性和局限性。若有多种相关动物种属/模型，且这些动物种属/模型可提供互补的证据，建议采用多种动物种属/模型开展研究。

根据既往研究经验和文献报道，目前细胞产品治疗关节疾病的药效试验中最常采用的动物种属是大鼠和兔，因此大鼠和兔也成为后续毒理学评价（关节内给药试验）中优先选用的相关动物种属。考虑到细胞产品在动物体内的存活时间，对于细胞产品的体内成瘤性和致瘤性风险评估则多采用免疫缺陷小鼠或大鼠。

2.剂量设计

2.1安全药理

安全药理学试验主要对所观察到的不良反应的剂量反应关系进行研究，因此，药效学剂量或人拟用的有效剂量是剂量设计重要的参考。一般情况下，低剂量应包括或超过药效学有效剂量或治疗范围，高剂量会参考重复给药试验中产生毒性反应的最低剂量。由于受到干细胞产品的细胞浓度的影响，剂量间距通常有限，因此可设置两个剂量组进行试验。

2.2一般毒理学

通常情况下，一般毒理学试验应保持合适的剂量间距，有助于评估毒性反应-剂量关系的陡峭程度和 I 期临床剂量递增方案的设计。高剂量一般期望获得明显毒性反应的相关信息，通常为药效学最高剂量的一定倍数或拟推荐临床最高剂量的一定倍数。关节腔给药的最高剂量设置会受到动物关节腔容量/大小和制剂最高浓度的限制，通常选择最大可行剂量。低剂量的设置可参考药效学起效剂量或临床拟用剂量，在保证一定倍数的情况下，确保至少在低剂量下可以获得NOAEL剂量。由于剂量间距有限，一般毒理学试验也可设置两个剂量组进行试验。

2.3成瘤性和致瘤性

高剂量组给药部位：关节囊炎症

试验项目：兔重复毒性试验

动物种属：新西兰兔

供试品：人脐带间充质干细胞

给药方式：双侧膝关节腔给药，200 μL/侧，Q2W，给药4周，恢复4周

试验结果：

（1）临检：高剂量组雌雄动物NEUT、MONO、EOS绝对计数及比例升高。

（2）组织病理学：给药期结束，高剂量组动物给药部位可见关节囊炎症，停药后有恢复趋势。

（3）主要毒性反应：仅局限于给药局部组织刺激性和相关炎症细胞变化。

高剂量组给药部位：关节囊炎症

试验项目：成瘤试验

试验体系：NPG小鼠

供试品：人脐带间充质干细胞

给药方式：单次皮下注射

试验结果

（1）试验体系：阳性对照组全部动物给药部位Hela细胞瘤均呈进行性生长；阴性对照组动物未见肿瘤形成或转移，说明本试验体系建立成功。

（2）组织病理学：仅阳性对照组给药部位可见Hela细胞瘤；阴性对照和供试品各剂量组动物均未见肿瘤形成和转移。

结论：供试品在体内无成瘤性风险。

高剂量组给药部位：未见肿瘤形成

高剂量组肺脏：未见肿瘤形成